蛋白質轉譯後修飾

蛋白質轉譯後修飾作用對於調控細胞中各式蛋白質所執行的功能相當重要。一般而言,我們無法由基因序列預測胺基酸殘基(amino acid residue)結構的改變修飾作用。此外,轉譯後修飾的鑑定過程常缺乏靈敏的方法與足夠的樣品量以供分析。雖然蛋白質修飾相當複雜,但結合適當酵素、化學切割、新的分離技術及高解析質譜儀,大大提升了成功鑑定出轉譯後修飾的可能性。我們提供多種轉譯後修飾分析服務如下:

  • 雙硫鍵結分析(Disulfide Bridge Analysis)
  • 醣基化(Glycosylation)
  • 磷酸化(Phosphorylation)
  • 其它多種轉譯後修飾作用(Other PTMs)
雙硫鍵結分析

雙硫鍵在蛋白質結構中扮演著穩定三級結構功能的重要角色。雙硫鍵的數量與鍵結位置決定了蛋白質是否能正確摺疊並能否正常執行功能。典型的例子為一般抗體之結構中,包含數個在heavy chain與light chain間分子內或分子間的鍵結。有正確的Y型結構,抗體才具有專一地辨認與結合抗原的功能。雙硫鍵結分析包含使用適當的切割酵素或化學反應,搭配質譜儀分析以鑑定出雙硫鍵結位置。由於雙硫鍵結分析與一般胜肽分析不同,它可能連接了兩個以上的胜肽片段而有著立體結構,其質譜數據無法直接以資料庫搜尋來分析,必須經過人工解讀圖譜,才能正確地判斷雙硫鍵結位置。本公司開發出以質譜技術為基礎的創新分析策略,不僅使用少量蛋白質(μg 層級 ),搭配自動化軟體做初步篩選,可在較短的分析時間內鑑定出樣品之雙硫鍵結位點資訊。相關研發成果已應用至多種單株抗體藥物的分析,並發表於國際期刊。

磷酸化

蛋白質磷酸化對於生理功能的調控相當重要,包含細胞內的訊息傳遞(signal transduction)、細胞生長(cell growth)、分化(differentiation)、代謝(metabolism)與細胞間溝通(cell-cell communication)等。Serine、Threonine、Tyrosine (主要出現於真核生物)與Histidine或Aspartate(主要出現於原核生物)的磷酸化與去磷酸化已知是調節酵素活性與訊息傳遞路徑的重要修飾作用。一般而言,磷酸化蛋白質在生物體中的含量偏低,且某些形式的磷酸化(如p-Ser與p-Thr)並不穩定。此外,磷酸化胜肽帶負電的特性,導致在質譜儀中的訊號常因非磷酸化胜肽的存在而被抑制。然而,某些分析方法已被發展進而增加磷酸化胜肽的量,如抗體辨識(antibody recognition)、金屬親和性層析(affinity tag chromatography)與化學修飾作用等。本公司利用金屬離子親和層析管柱(IMAC)或二氧化鈦(TiO2)層析方法增加磷酸化胜肽含量以鑑定磷酸化位點。此方法適用於重組蛋白或部分純化之蛋白樣品;而針對生物樣品內大規模的磷酸化蛋白質分析,我們同樣提供客製化分析服務,利用二步驟濃縮的策略(two-step enrichment),先純化磷酸化蛋白質,或直接進行酵素消化(protease digestion)並以陽離子層析(SCX)先對整體胜肽做分離,再進一步濃縮磷酸化胜肽,這樣的方法適用於分析鑑定大規模的磷酸化蛋白體,可大幅提高所鑑定到磷酸化蛋白質的數量。此方法亦可導入同位素標定,進而分析不同處理條件下,生物樣品中磷酸化蛋白質含量的改變。質譜分析與傳統跑膠與螢光標記方法不同的是,此分析是直接針對特定磷酸化位點做定量(site specific quantification),非常適合用在磷酸化激酶(kinase)與去磷酸酶(phosphatase)相關的訊息傳遞路徑之研究。

其它多種轉譯後修飾作用

截至目前為止,有超過200種以上的轉譯後修飾種類被發現。在Lysine殘基(residue)上乙基化(acetylation)、甲基化(methylation)、泛素化(Ubiquitination)與SUMO(sumoylation)的修飾作用常涉及基因轉錄調控(transcriptional regulation),其它類型的轉譯後修飾,如去胺基化(deamidation)、氧化(oxidation)、醯化(acylation)與羥基化(hydroxylation)對於調控蛋白質活性亦相當重要。而高靈敏度的分析方法對於低作用含量(low stoichiometry)的修飾作用有更大的助益效果。要分析這些轉譯後修飾作用,可以利用精確完整分子量測定、質譜分析圖譜比對與胺基酸序列分析等策略。我們提供完整的客製化分析套裝方案,協助客戶找出目標蛋白質上的轉譯後修飾之完整資訊。