蛋白質醣基分析

醣基化是自然界中蛋白質或生物製劑最常見的蛋白質轉譯後修飾作用之一,也是ICH Q6B所要求之轉譯後修飾分析項目之一。醣蛋白質上所修飾醣類的多樣性可能會影響此蛋白質的摺疊(folding)、胞內移位(subcellular localization)、穩定性(stability)、免疫引發性(immunogenicity)或配體結合(ligand binding)能力,進而影響此蛋白質能否發揮正常功能。N-linked與O-linked醣基化是兩種主要醣連結方式,其中N-link是透過與Asparagine上的氨基(amine)結合,O-link則是與Serine或Threonine的羥基(hydroxyl)結合。醣鏈內容與醣化位點的資訊對於生物藥品製造的品質管制相當重要,分析O-link與N-link的醣基化修飾有不同的方法。針對不同蛋白質之需求,我們提供以下分析套裝服務:

醣基化位點分析(Glycosylation Site)

醣結構分析(Carbohydrate Structure)

醣鏈圖譜分析(Glycan Profiling)

醣基化位點分析

醣基化位點分析可找出醣鏈在醣蛋白質上修飾連接的位置。這項資訊對於研究人員確認醣鏈的所在位置於不同批次間或不同細胞株的一致性而言相當重要。我們利用化學或酵素方法,將N-linked 或O-linked之醣基移除,再藉由液相層析結合串聯式質譜儀,鑑定醣基連接的位置。二次質譜圖上的斷片(fragment ions)資訊,可以正確地提供醣基修飾為點的資訊。

醣結構分析

ICH Q6B要求對於醣蛋白生物製劑的醣結構分析必須要廣泛且全面性的,包括醣鏈的分歧型態(antennary profile)和醣基化的位點。泛甲基化(permethylation)是一種常被應用在醣結構分析的化學衍生化(derivatization)方法,藉由將醣基上游離的OH group轉換成較疏水性且穩定的O-methyl group,可以在質譜分析時不僅增強訊號強度,也更有利於醣結構的鑑定。醣蛋白的醣結構分析可以幫助我們對於所屬醣類型(glycan type),分岐型態(glycan antennary),海藻醣(fucose)修飾和末端單醣(termini residue)有更深入的了解。由於醣基修飾類型對於最終醣蛋白生物製劑的品質、安全性和有效性有非常重要的影響,因此詳細且深入的醣結構分析對於上游細胞株挑選(clone selection)、發酵培養最佳化(condition optimization)到下游純化製程(purification process)開發,都是不可或缺的。

醣鏈圖譜分析

醣鏈圖譜鑑定用於表示醣蛋白質上N-醣鏈或O-醣鏈完整的醣鏈圖譜分佈。這是蛋白質執行生物功能的重要特徵,舉例說明,特定醣鏈型式的單株抗體可透過與不同Fc受體(Fc receptor)的交互作用,引發較強的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC),如此便可增加治療效果。多醣分佈(oligosaccharide population)分析是生物相似藥(biosimilar)比對分析的應用工具,常使用於確認製造過程中不同批次樣品間的一致性。這項方法亦適用於開發階段中篩選最佳化的細胞株。2-Aminobenzamide(2-AB)化學標定方法經常應用於醣鏈圖譜分析。N-連結與O-連結的醣質分子經由酵素PNGase F或鹼性β-去除法(alkaline β-elimination)與醣蛋白質分離後,2-AB可與每個多醣分子結合,再經由HILIC層析分離與螢光測定,即可得知各多醣之分子數量。而不同的醣化合物之混和物質的結構資訊可由後續之質譜圖譜分析所獲得。醣鏈圖譜分析對於ICH Q6B所建議生物製劑定性之遵循指引相當重要。