蛋白質相對定量

以質譜分析為基礎的定量蛋白質體學已逐漸成為一項重要且功能強大的工具,可用做系統化地解析不同樣品間的表現量差異。這項技術廣泛地應用在生物醫學或臨床研究中,找尋生物標誌(biomarker)或探討致病機轉。相異於分析偵測訊息核糖核酸(mRNA)表現量所得之基因訊息,定量蛋白質體學完整地檢視接受不同刺激的細胞狀態下,不同的細胞族群內整體蛋白質之相對或絕對含量,解析蛋白質活性或修飾作用,及了解蛋白質間交互作用關聯。這些富含資料性的結果對於開發新藥候選標的(drug candidate),或找尋診斷與預後的生物標誌是相當有用的。針對蛋白質相對定量,我們提供兩種化學同位素標定分析方法,分別為雙甲基標定(dimethyl labeling)與iTRAQTM(isobaric tag for relative and absolute quantitation)標定;而對生物標記確認或是絕對定量,我們提供多重反應監視技術(MRM or PRM)分析平台,可以針對目標蛋白進行定量分析。藉由這些方法,可同步獲得定性與定量的資料結果,有助於更全面地了解系統生物學。

化學標定方式

由於質譜訊號隨著胜肽的胺基酸組成不同,以及整體樣品的組成不同而有所差異,因此導入同位素標記方式,可以在同一立足點上比較兩組樣品在不同處理下,同一胜肽片段的含量。使用同位素標記分析蛋白質相對含量之基本步驟如下:

1.     樣品前處理(如沉澱)以及蛋白質樣品酵素水解

2.     以不同之同位素試劑標記各個樣品

3.     標記之樣品混和並經由強陽離子交換液相層析進行分離

4.     所收集的樣品(fractions)經去鹽後,進行液相層析連接串聯式質譜儀分析

5.     圖譜資料處理/資料庫比對/蛋白質定性與定量分析

 

我們使用iTRAQTM或雙甲基標定法進行以上蛋白質相對定量分析。iTRAQTM技術(Applied Biosystems公司之商品) 是利用四個或八個等重的化學標定試劑進行標定反應,其定量資訊可藉由比較二次質譜圖中的reporter ions取得。雙甲基標記則是藉由計算各胜肽片段的波峰下的面積(peak area by XIC),取得不同樣品中相同胜肽的定量資訊。同時二次質譜所獲得的圖譜資訊經過蛋白質資料庫的比對分析後,可鑑定出蛋白質身份。一般來說,上千個蛋白質(對應上萬個胜肽片段)可以在同次的分析中同時被定性與定量。藉由搭配適當的樣品前處理純化方式,此定量方法亦可用於蛋白質轉譯後修飾之定量分析。除此之外,我們亦針對各種不同來源的生物樣品,設計客製化解決方案,以最專業的技術提供您高品質的分析數據結果。

多重反應監測模式量化

多重反應監測模式(MRM, Multiple Reaction Monitoring)技術可應用於補足散彈式蛋白質體學(Shotgun Proteomics)的不足,它能夠有效量化複雜樣品內含量低的分析物。這是以質譜為基礎非全掃描式(full scan mode)的技術,透過三重四級棒(triple quadrupole)質譜儀的前後兩個質譜篩選器(mass filter),篩選已選定的母離子(precursor ion)與其片段離子(fragment ion)進行分析,可大幅增加定量分析的靈敏度。透過特定篩選反應監測模式(SRM, Selected Reaction Monitoring)的轉換,能同時鑑定與量化標的胜肽;此外,本公司亦提供以新式高解析質譜儀(Orbitrap)應用類似的質譜偵測模式(PRM, Parallel Reaction Monitoring)同時進行胜肽的定性與定量。若搭配穩定同位素標定的胜肽片段作為內部標準品(internal standard),亦可對特定蛋白質分析物的濃度進行相對或絕對定量。在針對複雜樣品中的特定標的蛋白質進行篩選定量時,此檢測方法具有許多條件優勢:高靈敏度,絕對專一性,同時監測多個標的,與高精準度。以質譜為基礎的定量方法提供了酵素連結免疫吸附法(ELISA)與以抗體為主的分析方法外,一種額外兼具多項優點的分析技術。在此,我們提供客製化方案,協助您偵測與量化複雜的分析樣品內您所感興趣的蛋白質。